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BUNSEN本生帶您了解:怎樣分析ELISA試劑盒包被和封閉問(wèn)題
一、 Elisa試劑盒包被方式
將抗原或抗體固定在過(guò)程稱(chēng)為包被(coating)。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過(guò)物理吸附結(jié)合的,靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用。這種物理吸附是非特異性的,受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。
大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán),故更易吸附到固相載體表面。不易吸附的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用,包被在固相上的抗原純度大大提高,因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法。
親和素生物素即用親和素先包被載體,加入生物素化的DNA,ELISA試劑盒這種包被方法均勻、牢固,已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測(cè)定。脂類(lèi)物質(zhì)無(wú)法與固相載體結(jié)合,可將其在有機(jī)溶劑(例如乙醇)中溶解后加入ELISA板孔中,開(kāi)蓋置冰箱或冷風(fēng)吹干,待酒精揮發(fā)后,讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。
優(yōu)點(diǎn):試驗(yàn)的特異性、敏感性均由此得以改善,重復(fù)性亦佳??乖昧可伲瑑H為直接包被的1/10乃至于/100。
二、包被用抗原
天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類(lèi)。合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一個(gè)抗原決定簇,純度高,特異性也高,但由于分子量太小,往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附,間接地結(jié)合到固相載體表面。
三、包被用抗體
IgG對(duì)聚苯乙烯有強(qiáng)吸附力,其聯(lián)結(jié)發(fā)生在Fc段上,ELISA試劑盒抗體結(jié)合點(diǎn)暴露于外。取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液.須除去雜抗體后才能用于ELISA,以保證試驗(yàn)的特異性。
腹水中單抗的濃度較高,特異性亦較強(qiáng),因此不需要作吸收層析處理,直接包被。在某些情況下,用多種單抗混合包被,可取得更好的效果。
四 、包被的條件
pH9.6碳酸鹽緩沖液
pH7.2的磷酸鹽緩沖液
pH7-8的Tris-HCL緩沖液
加入包被液后,在4-8℃冰箱中放置,37℃中保溫2小時(shí)。ELISA試劑盒包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化,每批材料需通過(guò)實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml。
二、Elisa試劑盒封閉問(wèn)題
封閉是ELISA實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)步驟,而封閉的重要性是在于實(shí)驗(yàn)?zāi)J降模裉焐虾:氵h(yuǎn)和您一起重點(diǎn)來(lái)看這個(gè)問(wèn)題。
抗原或抗體包被時(shí)所用的濃度較低,吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙,封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙,從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。
封閉劑:
1. zui常用的是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白。
2. 也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。
3. 脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑,其zui大的特點(diǎn)是價(jià)廉,可以高濃度使用(5%)。
4. 高質(zhì)量的速溶食用低脂奶粉即可直接當(dāng)作封閉劑使用,但由于奶粉的成份復(fù)雜,而且封閉后的載體不易長(zhǎng)期保存,因此在試劑盒的制備中較少應(yīng)用。
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